2019年12月05日國(guó)家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評(píng)中心發(fā)布一版《腫瘤相關(guān)突變基因檢測(cè)試劑（高通量測(cè)序法）性能評(píng)價(jià)通用注冊(cè)技術(shù)審查指導(dǎo)原則(2019年第83號(hào))》  （以下簡(jiǎn)稱(chēng)“指導(dǎo)原則”），該指導(dǎo)原則是針對(duì)腫瘤相關(guān)基因檢測(cè)試劑分析性能評(píng)價(jià)的一般要求延伸，性能評(píng)價(jià)主要思路是：提出產(chǎn)品性能有效性效高化、安全性相關(guān)問(wèn)題的假設(shè)機製性梗阻，然后通過(guò)研究進(jìn)行確認(rèn)大幅增加。

參考品作為性能評(píng)價(jià)的主要原材料探索創新，可謂是非常重要高品質，文中對(duì)此做了詳細(xì)的要求充分發揮，今天我們就參考品做一些討論發力。

原文：
4. 參考品要求
內(nèi)部參考品是保證產(chǎn)品性能穩(wěn)定性以及檢測(cè)值可溯源的重要構(gòu)成之一。參考品研究應(yīng)包括原料選擇迎來新的篇章、制備過(guò)程共創美好、定值研究及評(píng)價(jià)指標(biāo)等。申請(qǐng)人應(yīng)對(duì)內(nèi)部陽(yáng)性/陰性參考品的來(lái)源空白區、基因序列設(shè)置等信息進(jìn)行驗(yàn)證協調機製，并提供參考品溯源過(guò)程的測(cè)量程序或參考方法的相關(guān)信息及詳細(xì)的驗(yàn)證資料。
具體要求如下：
4.1陽(yáng)性參考品及陽(yáng)性質(zhì)控品：
4.1.1陽(yáng)性參考品
理想狀態(tài)下形勢，陽(yáng)性參考品應(yīng)當(dāng)包括對(duì)所申報(bào)產(chǎn)品每個(gè)基因型的質(zhì)控樣本實踐者。但考慮到基于NGS技術(shù)的可檢測(cè)基因數(shù)量較多，申請(qǐng)人應(yīng)結(jié)合產(chǎn)品預(yù)期用途約定管轄、臨床意義及基因類(lèi)型等因素進(jìn)行針對(duì)性和代表性的設(shè)計(jì)數據。
對(duì)于有明確腫瘤伴隨診斷相關(guān)的基因，應(yīng)考慮該類(lèi)基因參考品設(shè)置的合理性和完整性發揮，需包括伴隨診斷相關(guān)的全部熱點(diǎn)基因顯著，建議采用臨床樣本或細(xì)胞系提取的核酸儲(chǔ)備液作為原料。
對(duì)于具有顯著臨床意義或潛在臨床意義的基因開放以來，應(yīng)考慮代表性問(wèn)題占，明確具有臨床診斷意義的基因類(lèi)型及基因型中不同的變異類(lèi)型。突變頻率、變異類(lèi)型的選取應(yīng)具有代表性激發創作，包括不同外顯子前景，不同基因變異突變等。
如檢測(cè)編碼區(qū)較大且存在非熱點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)（如大于1M）增幅最大，建議在陽(yáng)性參考品中考慮對(duì)檢測(cè)整體區(qū)域的靈敏度驗(yàn)證（主要關(guān)注SNV等）共享應用，如混合的永生化正常人白細(xì)胞DNA儲(chǔ)存液等。
不同突變/變異的變異豐度及突變頻率標準，濃度范圍設(shè)置應(yīng)具有代表性并提供這樣設(shè)定的依據(jù)示範推廣。陽(yáng)性參考品的突變形式及拷貝數(shù)需采用有效方法進(jìn)行確認(rèn)，并明確接受標(biāo)準(zhǔn)即將展開。申請(qǐng)人在設(shè)計(jì)陽(yáng)性參考品時(shí)可一并考慮檢測(cè)限參考品的設(shè)置及確認(rèn)方式大幅增加，并提供相關(guān)的依據(jù)。
4.1.2陽(yáng)性質(zhì)控品
模擬病人樣本的目標(biāo)核酸序列傳承，并用于質(zhì)控整個(gè)檢測(cè)過(guò)程交流研討，包括核酸提取（如適用）方案、文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序和數(shù)據(jù)分析十大行動。目前陽(yáng)性質(zhì)控檢測(cè)和分析過(guò)程應(yīng)與臨床樣本方式一致左右。
4.2陰性參考品及陰性質(zhì)控品
陰性參考品及陰性質(zhì)控品建議為正常臨床樣本的混合物或細(xì)胞系，應(yīng)明確不含有目標(biāo)區(qū)域腫瘤突變基因綜合措施。
4.3精密度參考品
精密度參考品設(shè)置要求可參考陽(yáng)性/陰性參考品可靠保障。
4.4 PCR 試劑無(wú)模板質(zhì)控品（No Template Control，NTC）（如適用）
申請(qǐng)人應(yīng)根據(jù)申報(bào)產(chǎn)品特點(diǎn)設(shè)置NTC質(zhì)控品及檢測(cè)接受標(biāo)準(zhǔn)設計標準，監(jiān)測(cè)檢測(cè)過(guò)程中是否存在污染開展。

從原文中可以看出：
1.參考品是必須要的；
2.陽(yáng)性參考品設(shè)置zui為復(fù)雜發揮重要帶動作用，著重聚焦臨床意義的基因位點(diǎn)意向，不要求全覆蓋，同時(shí)要考慮靈敏度（zui低檢出限LoD）設(shè)置文化價值，考慮到濃度梯度或突變梯度的不同形式，應(yīng)對(duì)各水平陽(yáng)性參考品設(shè)置相應(yīng)檢出要求；
3.陽(yáng)性質(zhì)控品應(yīng)該匹配整個(gè)檢測(cè)過(guò)程不斷完善，檢測(cè)和分析應(yīng)該與臨床樣本一致數字化，用于陽(yáng)性、陰性的判斷基礎上；
4.陰性參考品和陰性質(zhì)控品可以為正常臨床樣本或者細(xì)胞系各領域，可以?xún)烧哂猛粋€(gè)；
5.精密度參考品主要用于使用相同的樣本（包括檢測(cè)臨界值附近的樣本）在各種特定條件下進(jìn)行檢測(cè)（如不同操作員，不同操作條件進行培訓，不同檢測(cè)天數(shù)發展機遇，不同儀器等），并考慮檢測(cè)中主要的變異來(lái)源組織了，通過(guò)重復(fù)性檢測(cè)來(lái)評(píng)價(jià)性能服務體系；
6.NTC主要是用于分析特異性，評(píng)估產(chǎn)品僅可檢測(cè)到預(yù)期待測(cè)變異的能力搶抓機遇。

綜上所述分析，對(duì)于參考品的設(shè)計(jì)，我們可以得出如下的表格（本設(shè)計(jì)僅代表小編個(gè)人意見(jiàn)）

按照這個(gè)思路全面闡釋，我們一步一步來(lái)設(shè)計(jì)一個(gè)完整的panel非常激烈。
首先di一步是選擇基因位點(diǎn)，可以按照如下原則來(lái)設(shè)計(jì)：
1.如果是一個(gè)小panel貢獻法治，一般設(shè)計(jì)都是針對(duì)某一癌種設備製造，對(duì)應(yīng)的基因都是比較明確，位點(diǎn)能明確的盡量明確攻堅克難，不能明確的盡量涉及多種類(lèi)型管理，比如SNV、Insertion雙向互動、Deletion效率和安、Fusion、CNV品牌，更細(xì)分的話深入開展，還有frameshift_variant、inframe_deletion等形式、inframe_insertion技術的開發、missense_variant、Splice_acceptor_Variant飛躍、Splice_Donor_Variant更高效、Synonmymous_Variant等等。
因此對(duì)應(yīng)的參考品要求覆蓋全基因重要部署，位點(diǎn)也盡量全覆蓋影響，參考品信息可以在科佰生物查詢(xún)，如果沒(méi)有的位點(diǎn)的過程中，可以聯(lián)系科佰生物定制位點(diǎn)發展契機。

2.如果是一個(gè)大panel，對(duì)于參考品促進進步、檢測(cè)限發力、精密度，一般是不可能做到所有基因全覆蓋，并且固定的%AF和CN值的共創美好，因此按照《指導(dǎo)原則》的要求推動並實現，我們應(yīng)該選擇具有臨床意義的基因和位點(diǎn)來(lái)表征，*的就是NCCN指南提及的基因覆蓋範圍，另外再加一些臨床藥物研發(fā)的靶點(diǎn)和biomarker優化程度。其中需要特別注意的是由于NGS的探針原理，不能很好的分析出每一種fusion的斷點(diǎn)信息（DNA層面奮勇向前，內(nèi)含子斷點(diǎn)不wei一）多種場景，因此建議大Panel選擇RNA作為fusion的檢測(cè)對(duì)象，同樣的也需要選擇RNA作為參考品規劃。

對(duì)于大panel的陽(yáng)性質(zhì)控品選擇擴大公共數據，可以選擇泛腫瘤的質(zhì)控品：

如下列舉了常見(jiàn)的重要的基因位點(diǎn)信息，供大家參考帶動擴大，panel的參考品盤(pán)可以從中選群诵募夹g體系。?/span>

（部分截圖）

有了選取的基因和位點(diǎn)，我們開(kāi)始依次設(shè)計(jì)參考品持續發展、質(zhì)控品必然趨勢、檢測(cè)限和精密度，

1.陽(yáng)性參考品盤(pán)

1.1根據(jù)目的選擇全盤(pán)的基因和位點(diǎn)擴大，比如按照癌種設(shè)計(jì)的方法；
1.2盡量覆蓋所有的基因和位點(diǎn)；
1.3盡量覆蓋SNV進行探討、indel、fusion和CNV服務水平；
1.4盡量多種突變細(xì)分類(lèi)型最新，尤其可以考慮一些內(nèi)含子的剪切變異；
1.5Fusion可以選擇DNA和RNA處理方法；
1.6多個(gè)位點(diǎn)要拆包設(shè)計(jì)重要作用，不能把臨近甚至相同位點(diǎn)放在一個(gè)包里面；
1.7設(shè)計(jì)的每個(gè)包突變頻率或者CN值固定習慣，這樣利于直接轉(zhuǎn)變?yōu)闄z測(cè)限標(biāo)準(zhǔn)品充足；
1.8不同包之間，盡量互補(bǔ)的積極性；
1.9一定要關(guān)注內(nèi)源突變的影響綠色化發展；
1.10如果能兼顧精密度、質(zhì)控盤(pán)的設(shè)計(jì)是合適的不久前，這樣能一個(gè)包多種用途用上了。

參考品盤(pán)設(shè)計(jì)好之后，就是實(shí)際落地去定制，這其中又涉及倍性關註、拷貝數(shù)的計(jì)算研究進展，還有終檢測(cè)的QC標(biāo)準(zhǔn)，一般是選擇DdPCR定標(biāo)機遇與挑戰，這些工作可以交給科佰生物廣泛關註，我們可以按照客戶的要求定制符合標(biāo)準(zhǔn)的參考盤(pán)混合標(biāo)準(zhǔn)品。

2.檢測(cè)限參考品
檢測(cè)限參考品的設(shè)計(jì)比較簡(jiǎn)單集成技術，只要將前面定制的參考品盤(pán)稀釋到待測(cè)的檢測(cè)限即可就能壓製，至于下降到什么標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)平臺(tái)發展空間、待測(cè)樣本等因素而定效果，一般靈敏度是早篩>液體活檢>組織檢測(cè)。

3.精密度參考品
精密度參考品一般是用于看體系的重復(fù)性足了準備，因此取決于實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)的變數(shù)多不多合作關系，對(duì)于單批次的參考品需要在不同條件下測(cè)試，同時(shí)不同批次的參考品也需要在不同條件下測(cè)試深刻內涵，尤其是LoD附近的檢測(cè)重復(fù)性傳遞。
因此如果能做到*把參考品的全部包都能充分驗(yàn)證精密度是佳的，但是這樣的話確實(shí)成本深入闡釋、周期都比較長(zhǎng)相關性，折中的選擇是盡量選擇全部的基因，位點(diǎn)可以是一部分物聯與互聯，選擇一個(gè)適中的突變頻率或者CN值穩定，再選擇一個(gè)LoD附近的突變頻率或者CN值（當(dāng)然一般建立體系時(shí)還未知LoD的范圍，因此這個(gè)可以后期測(cè)試）供給，來(lái)做精密度的性能評(píng)價(jià)優勢與挑戰。

4.陽(yáng)性質(zhì)控品盤(pán)
陽(yáng)性質(zhì)控品盤(pán)應(yīng)該匹配整個(gè)檢測(cè)過(guò)程，檢測(cè)和分析應(yīng)該與臨床樣本一致解決方案，用于陽(yáng)性趨勢、陰性的判斷。
4.1可以選擇細(xì)胞沉淀上高質量、石蠟塊這樣的樣品形式一站式服務，包含提取的過(guò)程；
4.2陽(yáng)性質(zhì)控品使用頻率高深入交流，可以批量制備引領作用；
4.3陽(yáng)性質(zhì)控品用于陽(yáng)性判斷，因此只要包含所有的基因臺上與臺下，不用所有的位點(diǎn)效率和安；
4.4陽(yáng)性質(zhì)控品用于陽(yáng)性判斷設計能力，出于容易檢出的目的，可以設(shè)計(jì)高一些的突變頻率和CN值極致用戶體驗。

科佰生物推出一款現(xiàn)貨陽(yáng)性質(zhì)控品盤(pán)提供有力支撐，包含基因多，突變種類(lèi)齊全建議，可以點(diǎn)擊表格查看品率。

推薦陽(yáng)性質(zhì)控品盤(pán)：

針對(duì)大panel的陽(yáng)性質(zhì)控品，可以考慮泛腫瘤大panel參考品不斷發展。

5.陰性參考品
陰性參考品建議為正常組織或者細(xì)胞系積極影響，只要明確不含有目標(biāo)區(qū)域腫瘤突變基因即可。這里需要提醒的有四點(diǎn)：
5.1陰性參考品用量比較大緊密協作；
5.2陰性參考品選擇容易制備越來越重要，而且穩(wěn)定的樣品，穩(wěn)定是指穩(wěn)定供應(yīng)發揮重要作用、基因組穩(wěn)定醒悟；
5.3陰性參考品的突變驗(yàn)證盡量選擇深度高的NGS或者DdPCR；
5.4陰性參考品還要測(cè)對(duì)應(yīng)基因的CN值和倍性高質量；

推薦陰性參考品：

6.陰性質(zhì)控品
參照5. 陰性參考品

現(xiàn)在分子診斷技術(shù)日新月異也逐步提升，傳統(tǒng)的PCR、Q-PCR註入了新的力量、AMRS-PCR重要的作用、FISH，一直都被大量用于臨床診斷去創新，到現(xiàn)在如日中天的NGS足夠的實力，越來(lái)越得到大家的認(rèn)可，再到下一代的三代測(cè)序結構，讀長(zhǎng)長(zhǎng)更適合，周期短，便攜規劃，未來(lái)預(yù)期美好。技術(shù)的革新給患者帶來(lái)新的希望深度，質(zhì)量保障是希望的前提帶動擴大，參考品盤(pán)是質(zhì)量檢測(cè)有力的工具。

我們呼吁業(yè)內(nèi)的每一家單位的每一個(gè)檢測(cè)開拓創新，都能用上參考品持續發展，對(duì)我們每一份發(fā)出的數(shù)據(jù)都能負(fù)責(zé)。